올리고뉴클레오티드 약물 및 인 시약-CTPPA의 화학적 합성에 대한 간략한 토론

(인 시약-CTPPA:2-시아노에틸 N,N,N',N'-테트라이소프로필포스포로디아미다이트 CAS 번호:102691-36-1)

핵산 약물 분야는 최근 몇 년간 상당한 주목을 받고 있습니다. 핵산의약품의 허가 및 출시가 가속화되고 있으며, 블록버스터 제품이 될 가능성이 있는 핵산의약품들이 심혈관 및 대사질환, 간질환, 각종 희귀질환 등의 분야에 대한 임상 데이터를 다수 공개하고 있다. 2025년 상반기 기준으로 ASO 의약품 13종, siRNA 의약품 7종, 리간드{7}}기반 의약품 2종 등 총 22종의 소형핵산의약품(이미 시장에서 퇴출된 의약품 포함)이 글로벌 시판 허가를 받았다.

분류별로 보면 ASO 의약품이 가장 큰 비중을 차지하고 있으며 시판 의약품 13개가 전체의 59.09%를 차지한다. 그 다음은 siRNA 약물로, 시판 약물 7개가 31.81%를 차지합니다. 적응증별로 보면 17개 약물은 유전적 희귀질환, 3개는 안과질환, 1개는 심혈관질환, 1개는 혈액종양합병증을 표적으로 삼고 있다. 적응증 분포는 '희귀질환을 주안점으로 하고, 여러 분야에 걸쳐 획기적인 발전을 이룬' 패턴을 보여준다. 소형핵산의약품의 임상적용이 점차 희귀질환 영역을 넘어 다른 질환 영역으로 확대되고 있는 것은 분명한 사실이다.

핵산 약물에 대한 연구가 증가함에 따라 다양한 올리고뉴클레오티드 약물의 대규모 생산이 점차 미래 추세가 될 것입니다. 그 중 화학적 합성은 단쇄 올리고뉴클레오티드를 합성하는 주요 방법입니다.- 반세기 이상의 개발을 거쳐 올리고뉴클레오티드의 화학적 합성법은 초기 포스포디에스테르법을 거쳐 포스포트리에스테르법, 포스파이트법을 거쳐 현재 성숙된 포스포르아미다이트법으로 진화해 왔다. 펩타이드 합성과 마찬가지로 올리고뉴클레오티드 합성도 또 다른 관점에서 보면 용액{4}}상 합성과 고체{5}}상 합성으로 나눌 수 있습니다. 이 기사에서는 가장 일반적으로 사용되는 "인 시약"과 뉴클레오시드 단량체 합성에 대한 응용을 소개합니다.

그림 1 인산화 시약 및 활성화 시약

올리고뉴클레오티드 합성에서 뉴클레오시드 단량체의 제조는 필수적인 단계입니다. 현재 다양한 뉴클레오시드 단량체를 합성하는 데 널리 사용되는 두 가지 주요 포스피틸화 시약이 있습니다. 하나는 2-시아노에틸 N,N-디이소프로필클로로포스포르아미다이트(1)[1]이고; 다른 하나는 비스(디이소프로필아미노)(2-시아노에톡시)포스핀(2)(그림 1) [2]. 2-시아노에틸 N,N-디이소프로필클로로포스포르아미다이트(1)는 가장 높은 반응성을 나타내며 알코올과 쉽게 축합됩니다. 대조적으로, 비스(디이소프로필아미노)(2-시아노에톡시)포스핀(2)은 알코올과 축합되기 전에 테트라졸과 같은 약산성 시약에 의해 촉매되는 현장 활성화가 필요합니다(그림 1). 실용적인 관점에서 볼 때, 2-시아노에틸 N,N-디이소프로필클로로포스포르아미다이트(1)는 비스(디이소프로필아미노)(2-시아노에톡시)포스핀(2)보다 더 비쌉니다. 높은 반응성으로 인해 2-시아노에틸 N,N-디이소프로필클로로포스포르아미다이트(1)는 분해되기 쉽고 사용 및 보관이 불편합니다. 또한 반응 중에 불순물이 추가로 유입되어 이상적인 순도와 수율이 떨어지는 경향이 있습니다. 따라서 비스(디이소프로필아미노)(2-시아노에톡시)포스핀(2)은 현재 뉴클레오시드 단량체 제조에 더 일반적으로 사용되는 포스피틸화 시약이며, 종종 "인 시약"으로 축약됩니다.

그림 2 테트라졸-촉매된 인산화의 반응 메커니즘

"인 시약"과 알코올 사이의 축합 과정에서는 일반적으로 화학양론적 또는 아화학양론적 양의 활성화 시약이 첨가됩니다. 가장 일반적으로 사용되는 활성화 시약에는 테트라졸, 4,5-디시아노이미다졸 및 피리디늄 트리플루오로아세테이트가 포함됩니다[3,4]. 현재, "인 시약"과 테트라졸에 의해 촉매되는 알코올 사이의 축합 반응 메커니즘이 철저하게 연구되었습니다[5-7].

반응은 다음과 같이 진행됩니다: 첫째, "인 시약"이 양성자화를 거치고; 그런 다음 디이소프로필아민은 테트라졸로 대체됩니다. 이후 테트라졸은 알코올로 대체됩니다(그림 2). 이들 단계 중에서 디이소프로필아민을 테트라졸로 치환하는 것이 속도-결정 단계입니다.

앞서 언급한 세 가지 활성화 시약 중에서 테트라졸은 가장 강한 산성도(pKa=4.89)[3]를 가지며 이는 아세트산(pKa=4.74)과 비슷합니다. 대조적으로, 4,5-디시아노이미다졸(pKa=5.20)[3] 및 피리디늄 트리플루오로아세테이트(pKa=5.23)[3]는 더 약한 산도를 나타냅니다.

뉴클레오사이드 단량체의 5'-하이드록실 그룹은 일반적으로 산에 불안정한 4,4'-디메톡시트리틸(DMT) 그룹에 의해 보호되기 때문에 테트라졸을 사용하면 DMT 탈보호의 부반응이 수반될 수 있습니다. 따라서 4,5-디시아노이미다졸(pKa=5.20) 및 피리디늄 트리플루오로아세테이트(pKa=5.23)가 때로는 더 이상적인 선택입니다.

또한 Koch et al. 4,5-디시아노이미다졸을 활성화 시약으로 사용하면 0.7당량의 시약만으로 완전한 전환이 가능하다고 보고했습니다. 반면, 1개 이상의 당량을 사용하면 이합체 부산물이 형성되기 쉽습니다[4].

"인 시약-CTPPA"의 특성

"인 시약"은 비등점이 비교적 높은(115도 /0.6Torr) 무색 또는 담황색 액체입니다. 이는 산소와 습기 모두에 민감하고 진공 증류 중에 쉽게 분해되는 경향이 있어-이 제품의 대규모 생산이 어렵습니다. 한편, 인 시약의 특성으로 인해 품질 검사도 상당한 어려움을 안고 있습니다. 사용자는 매 사용 후 시약을 질소로 보호하고 데시케이터에 보관해야 합니다. 이렇게 하면 시약의 사용 수명을 연장할 수 있습니다.

우리 회사는 거의 10년 동안 인 시약의 연구 개발 및 생산에 종사해 왔으며 제품 제조 및 테스트에 대한 광범위한 경험을 축적해 왔습니다. 현재 당사는-고순도 "인 시약"을 킬로그램 단위로 공급할 수 있습니다. 또한, 테트라졸, 4,5-디시아노이미다졸 등 관련 제품도 제공하고 있습니다. 관련 요구사항이 있는 친구가 당사에 연락하는 것을 환영합니다(표 1).

표 1 당사가 제조, 판매하는 관련 제품

참고자료

[1] 신하, ND; 맥마누스, J.; Köster, H. Nucleic Acids Research 1984, 12, 4539.

[2] 닐슨, J.; 타가드, M.; Marugg, JE 등. 핵산 연구 1986, 14, 7391.

[3] 상비, YS; 구오, Z.; Pfundheller, HM 등. 유기공정연구개발 2000, 4, 175.

[4] 페데르센 DS; Rosenbohm C.; Koch T. 종합 2002, 802.

[5] 누르미넨, EJ; 마티넨, JK; Lönnberg, H. Journal of Chemical Society, Perkin Transactions 2, 1998, 162.

[6] 베르너, S.; 뮐레거, K.; Seliger, H. Nucleic Acids Research 1989, 17, 853.

[7] 달, BM; 닐슨, J.; Dahl, O. Nucleic Acids Research 1987, 15, 1729.